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Design, Konstruktion und Charakterisierung neuer nanovibrativer Bioreaktoren für die Osteogenese - Phys.org

Spritzgusswerkzeugdesign und Formfüllungsanalyse unter Verwendung von Simulationen vor der Herstellung (A) Eine Explosionsansicht des Spritzgusswerkzeugs mit Kulturplatte zeigt die Hauptkomponenten der Formgrenzfläche und des Auswurfsystems. (B) zeigt die Formfüllungsanalyse, bei der geschätzt wird, dass der Teilehohlraum im Werkzeug 3,65 Sekunden benötigt, um ein fehlerfreies Teil vollständig zu füllen. Kredit: Wissenschaftliche Berichte, doi: 10.1038 / s41598-019-49422-4              In der regenerativen Medizin wollen die Wissenschaftler Techniken, mit denen die Bindung der Stammzellen gesteuert werden kann, deutlich voranbringen. Beispielsweise kann die mechanische Stimulation von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) im Nanomaßstab Mechanotransduktionswege aktivieren, um die Osteogenese (Knochenentwicklung) in 2D- und 3D-Kultur zu stimulieren. Solche Arbeiten können die Knochentransplantationsverfahren revolutionieren, indem Transplantatmaterial aus autologen oder allogenen MSC-Quellen erzeugt wird, ohne das Phänomen chemisch auszulösen. Aufgrund des wachsenden biomedizinischen Interesses an einer solchen mechanischen Stimulation von Zellen für den klinischen Einsatz benötigen sowohl Forscher als auch Kliniker ein skalierbares Bioreaktorsystem, um konsistent reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. In einer neuen Studie, die jetzt über wissenschaftliche Berichte veröffentlicht wurde, haben Paul Campsie und ein Team von multidisziplinären Forschern aus den Bereichen Biomedizintechnik, Informatik, Physik sowie Molekular-, Zell- und Systembiologie ein neues Bioreaktorsystem entwickelt, um die bestehenden Anforderungen zu erfüllen.                                                       Das neue Instrument enthielt eine Vibrationsplatte für Bioreaktionen, die für Nanometerschwingungen bei 1 kHz kalibriert und optimiert wurde, ein Netzteil zur Erzeugung einer Vibrationsamplitude von 30 nm und ein spezielles Kulturmaterial mit sechs Vertiefungen für das Zellwachstum. Die Kulturprodukte enthielten Magneteinsätze zur Befestigung an der magnetischen Vibrationsplatte des Bioreaktors. Sie bewerteten die osteogene Proteinexpression, um die Differenzierung von MSCs nach anfänglichen biologischen Experimenten innerhalb des Systems zu bestätigen. Campsie et al. Durchgeführte Rasterkraftmikroskopie (AFM) der 3-D-Gelkonstrukte, um zu verifizieren, dass während der Vibrationsstimulation keine Verformungshärtung des Gels auftrat. Die Ergebnisse bestätigten, dass die Zelldifferenzierung das Ergebnis von Nanovibrationsstimulationen ist, die nur vom Bioreaktor bereitgestellt werden. Die zunehmende Inzidenz von Skelettverletzungen aufgrund von altersbedingten Erkrankungen wie Osteoporose und Arthrose ist ein Maß für die Beeinträchtigung der menschlichen Lebensqualität. Die Entwicklung von Therapien zur Erhöhung der Knochendichte oder zur Frakturheilung ist ein Hauptziel für das Regenerationspotential von mesenchymalen Stammzellen (MSCs). Forscher haben die kontrollierte Osteogenese (Entwicklung von Knochen) von MSCs durch mechanische Stimulation unter Verwendung verschiedener Methoden, einschließlich passiver und aktiver Strategien, nachgewiesen. Passive Methoden verändern typischerweise die Substrattopographie, um das Zelladhäsionsprofil zu beeinflussen, während aktive Methoden die Exposition gegenüber verschiedenen Kräften von externen Quellen umfassen.                               Die FEA-Analyse wurde in ANSYS Workbench 17.1 durchgeführt, um das harmonische Verhalten bei 1 kHz auf der dreizehn und fünfzehn Piezo-Array-Deckplattenanordnung zu bestimmen. (A) Diagramm von dreizehn Piezo-Arrays. (B) Diagramm von fünfzehn Piezo-Arrays. (C) Vorausgesagte nanoskalige Verschiebung von dreizehn Piezo-Arrays bei 1 kHz. (D) Vorausgesagte nanoskalige Verschiebung von 15 Piezo-Arrays bei 1 kHz. Kredit: Wissenschaftliche Berichte, doi: 10.1038 / s41598-019-49422-4.              Die vorliegende Arbeit von Campsie et al. beabsichtigen, bereits bestehende Entwürfe für die kontrollierte Osteogenese von MSCs weiterzuentwickeln, um ein GMP-kompatibles System (Good Manufacturing Practice) für kleine klinische Studien zu entwickeln. Bei der Konstruktion verwendete das Team Laserinterferometrie, um die Schwingungsverschiebung von der oberen Platte des Bioreaktors und innerhalb der für Kulturgeschirr verwendeten Vertiefungen genau zu messen und die von ihnen entwickelten Geräte anhand von FEA-Modellen (Finite Elemental Analysis) zu validieren. Das Team verwendete einen DDS-Generator (Direct Digital Synthesis Waveform) und ein Rekonstruktionsfilter, um Hochfrequenzkomponenten des DDS-Ausgangs zu entfernen und so einen reinen Sinuswellenausgang von 1 kHz für präzise Nanovibrationen zu erzeugen.                                                                                      Das Forscherteam validierte den Betrieb des Bioreaktorsystems durch biologische Experimente zur Quantifizierung der osteogenen Proteinexpression von MSCs, die einer Nanovibrationsstimulation ausgesetzt waren. Sie führten AFM-Messungen an dem in den Experimenten verwendeten Kollagengel durch, um festzustellen, dass Vibrationen von der Kultur auf das Gel übertragen wurden. Dann zeigten sie, dass die Steifheit des Gels als Reaktion auf die auftretenden Nanovibrationen nicht signifikant anstieg.                               Messung des Wasserkontaktwinkels von PP-Kulturprodukten nach unterschiedlichen Dosen der Plasmabehandlung und mikroskopische Aufnahmen von MG63-Zellen (osteogenen Zellen) auf PP- und Polystyrol (PS) -6-Well-Platten. Eine graphische Darstellung der WCA-Messungen nach der Plasmabehandlung (A) zeigt, dass mindestens 30 Sekunden erforderlich sind, um die WCA signifikant auf ein Niveau zu verändern, bei dem die Zellen anhaften und sich vermehren können. Bilder von (B) Nichtadhärenz von MG63-Zellen auf der PP 6-Well-Platte vor der Plasmabehandlung, (C) Adhäsion und Proliferation von MG63-Zellen auf einer mit Plasma behandelten PP 6-Well-Platte und (D) MG63-Zellen, die auf einem Standard kultiviert wurden Corning PS 6-Well-Platte. Kredit: Wissenschaftliche Berichte, doi: 10.1038 / s41598-019-49422-4.              Campsie et al. konstruierte den Bioreaktor mit einer spezifischen Materialauswahl und einem Kulturgeschirraufsatz, um optimale nanoskalige Schwingungen zwischen den Frequenzen von 1 Hz und 5 kHz zu liefern. Sie stellten sicher, dass die Resonanzfrequenz der Vorrichtung deutlich über der Betriebsfrequenz lag, um eine Resonanzverstärkung oder -dämpfung zu verhindern. Um die geeigneten Abmessungen des Geräts zu bestimmen, führte das Forschungsteam eine FEA mit der ANSYS Workbench-Software durch. Die Wissenschaftler erstellten die Bioreaktoren kostengünstig, indem sie 13 bis 15 Piezo-Arrays für ihren Bau verwendeten. Das Produktdesign ermöglichte es den Zellen, unterschiedliche alternierende Bänder mit minimaler und maximaler Verschiebung zu erhalten, um uneinheitliche Vibrationsniveaus über die Kulturware hinweg zu erhalten. Das Team schätzte die Eigenresonanzfrequenz der Piezoaktoren und anderer Gerätekomponenten, um deren Einfluss auf den Versuchsaufbau zu verstehen. Das Forscherteam modifizierte dann die Oberflächenchemie der Kunststoffkultur, um die Zelladhäsion und -proliferation mithilfe der Plasmaoberflächenaktivierung zu unterstützen und die Oberflächenenergie des Polymers zu erhöhen. Nach fünf Minuten Plasmabehandlung auf Luftbasis kultivierten sie humane osteoblastenähnliche Zellen, um eine erhöhte Zellanhaftung an das Kulturgeschirr zu beobachten. Sie maßen den Wasserkontaktwinkel des Polymers, um die Oberflächenenergie der Modifikation und die Oberflächenbenetzbarkeit zu bestimmen. Die Wissenschaftler demonstrierten den Nachweis des Prinzips der Plasmaaktivierung von Polymerkulturprodukten und dessen Einfluss auf die Oberflächenbenetzbarkeit für eine günstige Zellanhaftung. Ziel war es, die Kulturoberflächen auf ähnliche Weise weiterzuentwickeln, um ihre Stabilität und Haltbarkeit zu gewährleisten.                               OBERSEITE: Bioreaktor-Vibrationsplatte mit spritzgegossenem 6-Well-Kulturgut aus PP. (A) Die verbesserte Version des Bioreaktors verfügt über eine leichtere Basis, Tragegriffe und eine versenkte obere Platte sowie ein Netzteil, das für die Ausgabe einer Sinuswelle mit 1 kHz und 30 nm Verschiebungsamplitude ausgelegt ist. (B) Spritzgegossenes PP-Kulturgut mit eingearbeiteten Halbach-Ferrit-Ringmagneten am Boden jeder Vertiefung. Die Dicke des Rahmens und der Wände der Vertiefungen beträgt 1,5 mm. UNTEN: Messaufbau und Ausgangssignal des Interferometers. (A) Um Verschiebungen im Nanobereich zu messen, sendet das Interferometer einen Laserstrahl vom Laserkopf aus, der vom Messobjekt zum Fotodetektor (auch im Laserkopf) zurückreflektiert wird. Durch Analyse des erzeugten optischen Interferenzmusters kann die Verschiebung erhalten werden. (B) Beispiel für die mit dem Interferometer gemessenen Zeitreihendaten. (C) Beispiel einer FFT-Analyse der Zeitreihendaten. Der 1 kHz-Peak des Bioreaktors ist deutlich zu sehen und es gibt auch einen großen Peak bei 750 Hz. Dieses Signal wird jedoch vom Referenzspiegel des Interferometers erzeugt, der konstant mit einer festen Frequenz angeregt wird, um die Steuerung zu erhalten Signale. Kredit: Wissenschaftliche Berichte, doi: 10.1038 / s41598-019-49422-4.              Das Forscherteam verbesserte das Design des Bioreaktors in der vorliegenden Arbeit erheblich, um eine leichtere Basis im Vergleich zu dem zuvor vorgestellten Prototyp zu bilden. Sie verwendeten einen AD9833-Leistungswellenformgenerator für die Stromversorgung mit einfacher Abstimmung und geeigneter Filterung, um ein reines 1-kHz-Sinuswellen-Treibersignal abzuleiten. Die Forscher erhielten ein Leistungsspektrum des vor- und nachgefilterten Signals, um die spektrale Leistungsdichte des Generators abzuschätzen. Sie überprüften die FEA-Modellierung und -Kalibrierung des Bioreaktors mithilfe eines Laserinterferometers, um Verschiebungsänderungen im Nanomaßstab zu bestimmen. Die Wissenschaftler verwendeten ein prismatisches Reflexionsband, das an die Unterseite jeder Vertiefung gebunden war, um die Abmessungen der Kulturgefäße zu messen, die magnetisch am Bioreaktor befestigt waren. Diese Technologie hat einen enormen Anwendungsbereich zur Erzeugung einer 3-D-mineralisierten Matrix aus MSCs, die in einem Kollagengel ausgesät sind, um Knochengerüste zu bilden. Beispielsweise erhielten kultivierte Zellen während der Vibration eine periodische Beschleunigungskraft, die auf die Zellmembran und das Zytoskelett einwirkte, um die Osteogenese zu induzieren. Der Effekt könnte auch mit der Umweltsteifheit in den Zellkulturmedien zusammenhängen, die die Stammzelldifferenzierung beeinflusst und stattdessen die Osteogenese in MSCs induziert. Um die Ursache zu unterscheiden, haben Campsie et al. verwendeten AFM, um jegliche Änderung der Steifheit zu detektieren, während sie das Kollagengel nanovibrierten. Sie beobachteten keine signifikanten Effekte der Verformungshärtung innerhalb des Gels, und der Elastizitätsmodul behielt die Werte von weichen Kollagengelen bei; Dies führt die Zelldifferenzierung allein auf Nanovibration zurück.



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